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Presentación
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La tecnología de DNA recombinante: principios y aplicaciones
Francisco Fontúrbel R.
Universidad Mayor de San Andrés, La Paz (Bolivia)
fonturbel@mbotanica.zzn.com
Tabla 1: Algunas de las principales enzimas de restricción conocidas y su origen (en base a Griffiths et al. 1998).
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Enzima de restricción |
Organismo de donde se extrae |
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EcoRI |
Escherichia coli |
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EcoRII |
Escherichia coli |
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HindII |
Haemophilus influenzae |
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HindII |
Haemophilus influenzae |
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HaeIII |
Haemophilus aegyptius |
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HpaII |
Haemophilus parainfluenzae |
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PstI |
Providencia stuartii |
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SmaI |
Serratia marcesens |
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BamI |
Bacillus amyloliquefaciens |
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BglII |
Bacillus globiggi |
Las enzimas de restricción trabajan únicamente sobre secuencias específicas de bases nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de restricción y producen dos tipos de corte: (1) corte con extremos cohesivos y (2) corte con extremos romos (ver Fig. 1) (Griffiths et al. 1998). Los extremos cohesivos dejan porciones lineales a ambos lados del fragmento, es decir, quedan pequeñas secuencias de bases sin aparear a cada lado, siendo éstas complementarias entre sí, mientras que los extremos romos son aquellos en los que no queda una porción lineal a ninguno de los lados. De acuerdo a la especificidad de las enzimas de restricción, se conocen dos tipos: las enzimas de tipo I cortan en un sitio cercano al sitio de restricción, a una distancia que varía aleatoriamente, y por ello no se suelen emplear para DNA recombinante. Las de tipo II reconocen y cortan en la secuencia específica, y son las más empleadas en este tipo de protocolos por su alta precisión. Las enzimas de restricción de tipo III son similares a las de tipo II en cuanto a la precisión del lugar de corte, pero se diferencian de éstas en que sólo cortan entre nucleótidos del mismo tipo, por ejemplo entre dos adeninas.
Fig. 1: Producción de extremos (a) cohesivos y (b) romos, por medio de enzimas de restricción en hebras de DNA.
Otro método para producir fragmentos pequeños de DNA para recombinación consiste en emplear ultrasonidos. Los ultrasonidos son capaces de romper al DNA cromosomal en pequeños fragmentos. A pesar de ser un procedimiento muy sencillo, tiene la desventaja de producir fragmentos aleatorios y no permite aislar genes con gran precisión (Mateos 2000), sin embargo son empleados por su facilidad de uso.
Algunas enzimas de restricción como EcoRV encuentran el sitio de restricción, por medio de un barrido a lo largo del surco mayor del DNA y reconocen una secuencia palindrómica de seis nucleótidos de longitud, en la que se presenta una simetría rotacional binaria. Cuando la enzima de restricción encuentra el sitio de corte, se producen una serie de reordenamientos estructurales en el DNA y se produce un ajuste inducido en el cual el DNA sufre una torsión de 50 grados. En este proceso se va haciendo un barrido muy rápido sobre la hebra de DNA, leyendo grupos de seis nucleótidos, hasta encontrar la secuencia diana. Esto comprueba el carácter altamente específico de las enzimas de restricción (Stryer 1995).
Los puntos de corte de las enzimas de restricción pueden ser empleados como marcadores para la elaboración de mapas de restricción (Mateos 2000). Para elaborar un mapa de restricción, se tiñen los fragmentos resultantes de la lisis y se los separa mediante una electroforesis PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida) (Smith & Wood 1998, Mateos 2000) y se establecen las distancias de migración, siendo los resultados muy específicos para cada molécula de DNA en estudio (Griffiths et al. 1998). Los extremos cohesivos son los más empleados en la construcción de DNA recombinante, puesto que al tener una porción lineal "pegajosa" es más sencillo que se produzca la unión con el DNA del hospedero, por complementación de bases, dicha unión se produce por la intervención de enzimas denominadas ligasas. Adicionalmente, la enzima transferasa terminal puede ser usada para generar extremos cohesivos en un fragmento de DNA. A pesar de ser más difícil, también es posible realizar uniones de extremos romos, mediante la adición de conectores sintéticos de DNA que actúan a manera de extremos cohesivos (como el caso de la transferasa terminal), sin embargo este procedimiento no es de mucha utilidad para realizar una clonación directa de DNA.
Existe otro tipo de enzimas de restricción de doble función, denominadas endo–exonucleasas, las cuales son capaces tanto de añadir nucleótidos como de removerlos de una hebra de DNA. Estas enzimas también son muy específicas y reconocen secuencias exactas (Bohinski 1991, Stryer 1995) Fraser (1994), plantea que las enzimas de restricción del tipo endo–exonucleasas pueden tener un papel fundamental en la reparación del DNA y/o en la muerte de células defectuosas, gracias a la especificidad de la enzima. Se han hecho numerosos experimentos con endo–exonucleasas aisladas de E. coli, Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, células de mono y células leucémicas de humano (Fraser 1994). Las potenciales aplicaciones en la medicina de estas enzimas podría llevar a curar varias enfermedades, este aspecto se verá a detalle más adelante.
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